Mikrobiologi Acara III STERILISASI DAN KERJA ASEPTIS

LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI PERTANIAN

ACARA III

STERILISASI DAN KERJA ASEPTIS

Disusun Oleh:

Nama         : Aprian Aji Santoso

NIM           : A1L010222

Kelas          : Agrotek D

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

FAKULTAS PERTANIAN

PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI

PURWOKERTO

2012

BAB I

PENDAHULUAN

A.      Latar Belakang

Salah satu bagian yang penting dalam mikrobiologi adalah pengetahuan tentang cara-cara mematikan, menyingkirkan, dan menghambat pertumbuhan mikroorganisme (Block, 2002). Cara yang digunakan untuk menghancurkan, menghambat pertumbuhan mikroorganisme dan menyingkirkan mikroorganisme berbeda-beda tergantung spesies yang dihadapi. Selain itu lingkungan dan tempat mikroba ini pun berbeda-beda misalnya dalam darah, makanan, air, sampah, roil, dan tanah. Hal tersebut juga dapat dijadikan sebagai bahan pertimbangan untuk menentukan cara untuk menghancurkan mikroorganisme yang digunakan tergantung pada pengetahuan, keterampilan dan tujuan dari yang melaksanakannya, sebab tiap situasi yang dihadapi merupakan kenyataan-kenyataan dasar yang dapat menuntun pada cara atau prosedur yang harus dilakukan (Levine, 2000).

Tindakan untuk membebaskan alat atau media dari mikroba adalah dengan sterilisasi. Secara umum, sterilisasi dapat dilakukan dengan cara mekanik, fisik dan kimia. Teknik aseptis dibutuhkan untuk mencegah ataupun mengurangi kontaminasi yang tidak diinginkan. Mikroba memiliki karakteristik serta ciri yang berbeda dalam persyaratan pertumbuhannya. Karakteristik persyaratan pertumbuhan mikroba inilah yang menyebabkan bermacam-macamnya media penunjang pertumbuhan mikroba. Dalam melakukan kegiatan tersebut diperlukan keahlian dan keterampilan khusus. Sterilisasi merupakan salah satu faktor utama dalam fermentasi. Kita tentu mengharapkan tidak terjadi kontaminasi di mana mikroorganisme yang tidak diinginkan tumbuh dan mengganggu proses fermentasi. Teknik sterilisasi berbeda-beda tergantung pada jenis material. Bagian pertama akan menjelaskan secara singkat dan sederhana bagaiman sterilisasi cairan dan padatan.

Sebelum melakukan percobaan dengan mikroorganisme, diperlukan proses dekontaminasi terlebih dahulu untuk meminimalisir organisme yang aktif dari suatu sistem bakteri atau virus. Dekontaminasi adalah proses menghilangkan atau membunuh mikroorganisme sehingga objek aman untuk ditangani, tujuannya untuk melindungi praktikan yang melakukan percobaan menggunakan bakteri atau semacamnya

Beberapa mikroorganisme memiliki resistensi terhadap dekontaminan kimia, seperti : bakteri vegetatif, jamur, dan virus yang mengandung lipida relatif yang mudah didekontaminasi dengan senyawa kimia. Virus yang tidak mengandung lipida dan bakteri berlapis lilin memiliki tingkat resistensi tinggi. Resistensi terhadap dekontaminan kimia dipengaruhi beberapa faktor, seperti : konsentrasi dari zat aktif, lamanya kontak, pH, suhu, kelembapan, dan kehadiran senyawa organik.

B.       Tujuan

Mampu melakukan sterilisasi menggunakan autoclave, filtrasi, tyndalisasi, dan kerja aseptis

BAB II

METODOLOGI PRAKTIKUM

A.      Bahan dan Alat

Bahan dan alat yang di gunakan yaitu autoclave, alcohol, hand sprayer dan media.

B.       Prosedur Kerja

1.       

BAB III

HASIL DA PEMBAHASAN

A.      Hasil

Terlampir

B.       Pembahasan

Sterilisasi dalam mikrobiologi berarti membebaskan tiap benda atau substansi dari semua kehidupan dalam bentuk apapun. Untuk tujuan mikrobiologi dalam usaha mendapatkan keadaan steril, mikroorganisme dapat dimatikan setempat oleh panas (kalor), gas-gas seperti formaldehide, etilenoksida atau betapriolakton oleh bermacam-macam larutan kimia; oleh sinar lembayung ultra atau sinar gamma. Mikroorganisme juga dapat disingkirkan secara mekanik oleh sentrifugasi kecepatan tinggi atau oleh filtrasi 

Macam-macam sterilisasi (Machmud, 2008):

Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisik dan kimiawi.

1. Sterilisai secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0.22 mikron atau 0.45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misal nya larutan enzim dan antibiotik.

2. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran.

Pemanasan

a. Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung, contoh alat : jarum inokulum, pinset, batang L, dll.

b. Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira 60-180⁰C. Sterilisasi panas kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer, tabung reaksi dll.

c. Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air lebih tepat menggungakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi.

d. Uap air panas bertekanan : menggunalkan autoklaf

-          Penyinaran dengan UV

Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Safety Cabinet dengan disinari lampu UV

3. Sterilisaisi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain alkohol.

Sterilisasi dengan panas adalah unit operasi dimana bahan dipanaskan dengan suhu yang cukup tinggi dan waktu yang cukup lama untuk merusak mikrobia dan aktivitas enzim. Sebagai hasilnya, bahan yang disterilkan akan memiliki daya simpan lebih dari enam bulan pada suhu ruang. Contoh proses sterilisasi adalah produk olahan dalam kaleng seperti kornet, sarden dan sebagainya. Perkembangan teknologi prosesing yang memiliki tujuan mengurangi kerusakan nutrien dan konponen sensoris dan juga mengurangi waktu prosesing menjadikan teknik serilisasi terus dikembangkan. Lamanya waktu sterilisasi yang dibutuhkan bahan dipengaruhi oleh: resistensi mikroorganisme dan enzim terhadap panas, kondisi pemanasan, pH bahan, ukuran wadah atau kemasan yang disterilkan, keadaan fisik bahan  (Machmud, 2008).

Sterilisasidengan udara kering, alat yang umum dikenal adalah oven. Alat ini dipakai untuk mensterilkan alat-alat gelas seperti erlenmeyer, petridish, tabunng reaksi dan alat gelas lainnya. bahan-bahan seperti kapas, kain dan kertas dapat disterilkan dengan alat ini. pada umunhya suhu yang digunakan pada sterilisasi secara kering adalah 170 - 180 C selama palinng sedikit 2 jam. Lama isterilisasi tergantung pada alat dan jumlahnya  (Machmud, 2008).

Sterilisasi dengan uap air panas, bahan yang mengandung cairan tidak dapat didterilkan dengan oven sehingga digunakan alat ini. alat ini disebut Arnold steam sterilizer dengan suhu 100⁰Cdalam keadaan lembab. Secara sederhana dapat pula digunakan dandang. Mula-mula bahan disterilkan pada suhu 100⁰C selama 30 menit untuk membunuh sel-sel vegetatif mikrobia. kemudian disimpan pada suhu kamr 24 jam untuk memberi kesempatan spora tumbuh menjadi sel vegetatif, lalu dipanaskan lagi 100⁰C 30 menit. dan diinkubasi lagi 24 jam dan disterilkan lagi, jadi ada 3 kali sterilisasi. Banyak bakteri berspora belum mati dengan cara ini sehingga dikembangkan cara berikutnya yaitu uap air bertekanan  (Machmud, 2008).

Sterilisasi dengan uap air panas bertekanan, alat ini disebut autoklaf (autoclave) untuk steriliasasi ini alat dilengkapi dengan katup pengaman. Alat diisi dengan air kemudian bahan dimasukkan. Panaskan sampai mendidih dan dari katup pengaman kelaur uap air dengan lancara lalu ditutup. Suhu akan naik sampai 121⁰C dan biarkan selama 15 menit (untuk industri pengalengan ada perhitungan tersendiri), lalu biarkan dingin sampai tekanan normal dan klep pengaman dibuka, cara ini akan mematikan spora dengan cara penetrasi panas ke dalam sel atau spora sehingga lebih cepat. Cara mana yang dipilih tergantung bahan, biaya dan ketersediaan alat, untuk bahan yang tidak tahan panas, maka cara diatas tidak dapat dipakai (Machmud, 2008).

Sterilisasi yang umum dilakukan dapat berupa:

a. Sterilisasi secara fisik (pemanasan, penggunaan sinar gelombang pendek yang dapat dilakukan selama senyawa kimia yang akan disterilkan tidak akan berubah atau terurai akibat temperatur atau tekanan tinggi). Dengan udara panas, dipergunakan alat “bejana/ruang panas” (oven dengan temperatur 170^o – 180^oC dan waktu yang digunakan adalah 2 jam yang umumnya untuk peralatan gelas).

b. Sterilisasi secara kimia (misalnya dengan penggunaan disinfektan, larutan alkohol, larutan formalin).

c. Sterilisasi secara mekanik, digunakan untuk beberapa bahan yang akibat pemanasan tinggi atau tekanan tinggi akan mengalami perubahan, misalnya adalah dengan saringan/filter. Sistem kerja filter, seperti pada saringan lain adalah melakukan seleksi terhadap partikel-partikel yang lewat (dalam hal ini adalah mikroba) (Suriawiria, 2005).

Macam-macam sterilisasi

Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisik dan kimiawi.

1. Sterilisai secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0.22 mikron atau 0.45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misalnya larutan enzim dan antibiotik.

2. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran.

· Pemanasan :

a. Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung, contoh alat : jarum inokulum, pinset, batang L, dll.

b. Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira 60-180⁰C. Sterilisasi panas kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer, tabung reaksi dll.

c. Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air lebih tepat menggungakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi.

d. Uap air panas bertekanan : menggunalkan autoklaf

· Penyinaran dengan UV

Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Safety Cabinet dengan disinari lampu UV

3. Sterilisaisi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain alkohol.

Gambar 2.1 Desinfeksi meja kerja (Machmud, 2008)

Teknik aseptis atau steril adalah suatu sistem cara bekerja (praktek) yang menjaga sterilitas ketika menangani pengkulturan mikroorganisme untuk mencegah kontaminasi terhadap kultur mikroorganisme yang diinginkan. Dasar digunakannya teknik aseptik adalah adanya banyak partikel debu yang mengandung mikroorganisme (bakteri atau spora) yang mungkin dapat masuk ke dalam cawan, mulut erlenmeyer, atau mengendap di area kerja. Pertumbuhan mikroba yang tidak diinginkan ini dapat mempengaruhi atau mengganggu hasil dari suatu percobaan. Mikroorganisme dapat juga ”jatuh” dari tangan operator, sarung tangan atau jas laboratorium karena pergerakan lengan yang relatif cepat. Penggunaan teknik aseptik meminimalisir material yang digunakan terhadap agen pengontaminasi. Pada kenyataanya teknik aspetis tidak dapat melindungi secara sempurna dari bahaya kontaminan. Namun semakin banyak belajar dari pengalaman maka semakin mengurangi resiko yang ditimbulkan.

Teknik aseptis digunakan pada saat :

- Teknik aseptis seharusnya digunakan saat kita bekerja dengan mikroorganisme hidup dan dengan segala media pertumbuhannya.

- Teknik aseptis sebaiknya digunakan ketika kita tidak ingin larutan dari suatu botol tidak berubah sifat akibat aktivitas mikroorganisme, seperti saat membuat buffer meskipun buffer dengan konsentrasi garam tinggi atau mengandung deterjen.

- Teknik aseptis disarankan pada saat kita bekerja menggunakan agen atau senyawa yang berbahaya seperti bahan kimia beracun atau bahan radioaktif. Tentu saja perlindungan diri sendiri dari bahaya senyawa ini lebih penting.

Beberapa contoh :

- Mentransfer biakan dari media satu ke media lainnya. Bakteri kontaminan yang tumbuh tentu saja dapat mengganggu kemurnian biakan dan mungkin saja membuat rancu hasil yang didapatkan.

- Memfilter media atau serum dan menghitung jumlah bakteri dengan cara filtrasi. Kontaminasi yang ikut tersaring dapat tumbuh pada media baru yang membuat tidak terpakainya media pertumbuhan tersebut atau mempengaruhi jumlah total bakteri.

- Membuka dan merehidrasi bakteri terliofolisasi. Teknik aseptis dapat menjaga sel yang terrehidrasi dari bakteri kontaminan dan menjaga tidak keluarnya sel ke meja kerja.

- Melakukan reaksi restriksi atau PCR. Walaupun enzim restriksi pada umumnya disimpan dalam gliserol 50% (bakteriostatik) tapi enzim yang diencerkan akan lebih rentan rusak akibat aktivitas mikroorganisme atau dihambat oleh ion atau unsur tertentu. Kontaminasi DNA asing yang masuk ke dalam tube PCR mungkin dapat teramplifikasi sehingga hasil yang didapat membingungkan.
- Melabeli sel dengan (32P) fosfat. Pada kasus ini kerja aseptis ditujukan untuk melindungi operator dari bahan kimia berbahaya. Jika menggunakan teknik aseptis maka Anda tidak akan membiarkan tutup bahan radioaktif terbuka atau secara tidak sengaja menggunakan pipet bekas bahan radioaktif.

Aturan umum teknik aseptis:

- Meja kerja sebaiknya jauh dari sesuatu yang dapat menciptakan aliran udara, misalnya tidak ada jendela yang terbuka, tidak dekat dengan pintu yang selalu dibuka-tutup dan jauh dari lalu-lintas orang. Penggunaan kabinet biosafety dapat menjaga dan mengatur aliran udara tetapi ini bukan merupakan suatu jaminan mutlak dari resiko terkontaminasi.

- Pastikan meja kerja bersih dari kotoran dan benda-benda yang tidak akan digunakan. Kultur tua atau pipet bekas seharusnya tidak berada di meja kerja. Kotoran seringkali sulit dibersihkan pada sudut-sudut ruang.

- Usap meja kerja dengan antiseptik atau senyawa pembersih lain sebelum digunakan. Di sebagian besar laboratorium umumnya menggunakan etanol 70% untuk membersihkannya. Sediakan etanol pada posisi selalu dekat dengan meja. Jika telah selesai bekerja, sebaiknya meja kerja dikosongkan dari peralatan dan bersihkan lagi.

- Semua peralatan (pipet, cawan dll.) yang digunakan harus steril. Sebaiknya semua peralatan yang telah disterilisasi diberi label. Jika menemukan alat yang sepertinya telah disterilisai tapi masih ragu terhadap sterilitasnya maka sebaiknya jangan digunakan. Bungkus peralatan baik alat steril sekali pakai atau bukan (pipet, syringe dll.)diperiksa terlebih dahulu apakah terdapat kebocoran atau tersobek.

- Atur peralatan di meja kerja sedemikian rupa sehingga meminimalisir pergerakan tangan. Alat-alat yang biasanya digunakan dengan tangan kanan (jarum inokulum, filler, pipet dll.) letakkan disebelah kanan begitu juga sebaliknya (rak tabung, cawan petri, erlenmeyer dll.) terkecuali untuk tangan kidal. Di bagian tengah meja kerja disediakan ruang lapang untuk bekerja.
- Membakar mulut atau bagian tepi dari suatu alat dapat membunuh mikroorganisme yang menempel.
- Telah siap dengan segala peralatan dan bahan yang dibutuhkan. Semua bahan dan alat untuk prosedur tertentu telah dipersiapkan di meja kerja. Jangan sampai meninggalkan meja kerja untuk mengambil sesuatu yang terlupa atau tertinggal. Perhitungkan semua yang diperlukan beserta cadangannya.

- Pakai sarung tangan lateks dan ganti secara berkala. Sarung tangan membantu melindungi dari tumpahan biakan atau bahan kimia berbahaya. Tidak menggunakan sarung tangan dirasa tidak bermasalah jika materi dan bakteri yang diteliti dipastikan tidak berbahaya.
- Cuci tangan sebelum dan sesudah bekerja. Cuci tangan dengan desinfektan atau sabun bila tidak ada desinfektan. Cuci tangan dapat membilas mikroorganisme yang ada di tangan.

Saran-saran teknik aseptis:- Minimalisasi gerak : pergerakan tangan dapat menciptakan aliran udara . semakin cepat pergerakannya semakin cepat aliran udara yang ditimbulkan. Pergerakan lengan sebaiknya dilakukan seperlu mungin dan bergerak secara lembut.

- Minimalisasi jarak: jarak antar peralatan diatur seefektif dan seefisien mungkn. Antar peralatan jangan diletakkan terlalu jauh.

- Minimalisasi keterpaparan : semakin sering menggerakkan sesuatu (mis: cawan berisi media) melewati udara maka semakin besar partikel udara untuk masuk. Semakin lama tutup erlenmeyer terbuka juga semakin besar terkontaminasi.

Catatan penting dalam kerja aspetis :

- Tutup erlenmeyer, botol atau cawan sebaiknya dibuka kira-kira 450. tujuannya untuk meminimalisasi udara masuk namun masih dapat mentransfer sesuatu.

- Jika diharuskan untuk membuka penuh dan tutup diletakkan di meja kerja, maka tutup dapat diletakkan tertelungkup atau terlentang (muka menghadap ke atas). Jika tertelungkup pastikan permukaannya bersih dan bila terlentang pastikan juga tidak ada gerakan di atasnya.

- Untuk menghindari bakteri yang menempel pada jarum inokulum terpental/terciprat maka diameter loops harus berkisar 2-3 mm dan untuk memperkecil getaran panjang kawat tidak lebih dari 6cm.

- Tidak boleh menyedot cairan pada saat pipeting dengan mulut.

- Untuk menghindari penyebaran mikroba dari tetesan pipet yang terjatuh maka dapat digunakan kain steril yang diberi desinfektan sebagai alas. Kain ini setelah selesai dibuang sebagai limbah berbahaya.

BAB IV

KESIMPULAN

Sterilisasi dengan penyaringan dilakukan untuk mensterilisasi cairan yagn mudah rusak jika terkena panas atu mudah menguap (volatile). Teknik aseptis pengerjaan mikrobiologi yang memerlukan ketelitian dan keakuratan disamping kesterilan yang harus selalu dijaga agar terbebas dari kontaminan yang dapat mencemari. Sedangkan, keduanya diperlukan untuk ketelitian , keakuratan dan kesterilan dari kontaminan dari suatu perlakuan.

DAFTAR PUSTAKA

Atlas, R.M.1946. Handbook Of Microbiological Media 3^th Edition. CRC Press: Amerika

Barker, Kathy. 1998. At The Bench, A Laboratory Navigator. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

Donacki, Nanci. 2004. Aseptic techniques used by Cell Culture specialists in handling products from and/or mammalian cells. http://protocol-online.org.

James, Daniel E., 2008. Nine Safe Practices for the Microbiology Laboratory Carolina Biological Supply, Burlington, NC.John C. Schof ield, B.V.Sc., M.R.C.V.S. Essentials for Animal Research:A Primer for Research Personnel : Principles of Aseptic Technique.http://www.unmc.edu/Education

Suhardi, S.H., Koesnandar, D. K. Indriani, H. Arnaldo. 2008. Biosafety : Pedoman Keselamatan Kerja di Laboratorium Mikrobiologi dan Rumah Sakit. PT. Multazam Mitra Prima.

Curtis, Helena, Barnes, N. Sue. 1999. Biology 5th edition. Worth Publisher Inc. New York

Pelczar, M. J., Chan, E.C.S. 2007. Elements of Microbiology. Mc Graw Hill Book Company. New York.