Mikrobiologi acara II Pembuatan Media Pertumbuhan

LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI PERTANIAN

ACARA II

PEMBUATAN MEDIA PERTUMBUHAN

Disusun Oleh:

Nama         : Aprian Aji Santoso

NIM           : A1L010222

Kelas          : Agrotek D

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

FAKULTAS PERTANIAN

PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI

PURWOKERTO

2012

BAB I

PENDAHULUAN

A.      Latar Belakang

Media biakan adalah media steril yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme.  Media biakan terdiri dari garam organik, sumber energi (karbon), vitamin dan zat pengatur tumbuh (ZPT).  Selain itu dapat pula ditambahkan komponen lain seperti senyawa organik dan senyawa kompleks lainnya (Soeryowinoto, 1985).

Media biakan yang mampu mendukung optimalisasi pertumbuhan milroorganisme harus dapat memenuhi persyaratan nutrisi bagi mikroorganisme. unsur tersebut berupa garam organik, sumber energi (karbon), vitamin dan zat pengatur tumbuh (ZPT).  Selain itu dapat pula ditambahkan komponen lain seperti senyawa organik dan senyawa kompleks lainnya (Soeryowinoto, 1985).

Untuk meneliti bakteri di laboratorium, kita harus dapat menumbuhkan mereka dalam biakan murni.  Untuk melakukan hal ini, haruslah dimengerti jenis-jenis lingkungan fisik yang menyediakan kondisi optimum bagi pertumbuhannya.  Dalam laboratorium, lingkungan fisik yang dimaksud adalah media biakan. Keragaman yang luas dalam hal tipe nutrisi diantara bakteri, diimbangi oleh tersedianya berbagai macam media yang banyak macamnya untuk kultuivasinya.  Macam media tersebut dapat dibagi berdasarkan bentuknya dan susunannya.

Berdasrkan bentuknya, media dibagi atas medis cair, semi cair dan padat.  Sedang menurut susunannya, media dapat dibagi atas media kompleks dan media sintetik. Adapun dalam percobaan ini, jenis media yang digunakan adalah jenis media PDA (Potato Dekstrose Agar) yang merupakan media padat dan tergolong media kompleks.

Jenis yang termasuk garam-garam anorganik berupa nitrogen terutama kalium nitrat (KNO₃), belerang (sulfur anorganik), fosfor dan unsure-unsur logam anorganik seperti natrium, kalium, kalsiuum, magnesium, mangan, besi, seng, tembaga, dan kobalt (Hendaryono, 1994).

Unsur karbon yang digunakan oleh Mikroorganisme dapat berupa pancaran atau cahaya dinamankan fototrof, dan yang lain adalah jenis kemototrofmenggunakan hasil oksidasi senyawa-senyawa kimia dalam media untuk memperoleh energinya (Hadioetomo, 1986).

Vitamin dalam media biakan berfungsi membentuk substansi yang mengaktivasi enzim.  Mikroorganisme memperlihatkan gejala yang berlainan dala pola pengambilan nutrisi.  Meskipun semua Mikroorganisme membutuhkan vitamin dalam proses metaboliknya, namun beberapa jenis Mikroorganisme nampu mensintesis kebutuhan vitaminnya sendiri dari senyawa-senyawa lain di dalam medium (Hadioetomo, 1986).

Zat pengatur tumbuh pada tanaman adalah senyawa organik bukan hara, yang dalam jumlah sedikit namun dapat mendukung, menghambat dan merubah proses fisiologi tumbuhan.  Zat pengatur tumbuh sangat diperlukan sebagai komponen medium bagi pertumbuhan dan diferensiasi, tanpa penambahan zat pengatur tumbuh dalam medium, pertumbuhan Mikroorganisme sangat terhambat bahkan mungkin tidak dapat tumbuh sama sekali (Gardener, 1993).

B.       Tujuan

Mampu membuat media pertumbuhan Nutrient Agar dan Potato Dextrose Agar

BAB II

METODOLOGI PRAKTIKUM

A.      Bahan dan Alat

1.      Nutrient Agar

-          Touge                   200 gr

-          Dextrose               19-20 gr

-          Agar                     15-20 gr

-          Aquades               1000 ml

2.      Potato Dextrose Agar

-          Aquades               250 ml

-          Kentang               50 gr

-          Dextrose               3,75 gr

-          Agar                     5 gr

B.       Prosedur Kerja

1.      Potato Agar

-         Kentang dikupas, dicuci sampai bersih  kemudian  dipotong  dadu 1 x 1 cm

-         Rebus kentang dengan air selama 20 menit (sampai kentang lunak).

-         Pisahkan kentangnya dan ambil airnya (ekstrak)

-         Tambahkan dekstrosa, agar dan air dalam ekstrak kentang hingga 1 liter

-         Tuangkan ekstrak tersebut ke dalam  tabung reaksi (10 ml atau kira-kira 1/3 dari tinggi tabung).

-         Sumbat tabung reaksi dengan kapas dan ditutup almunium foil/plastic anti panas.

-         Sterilisasi dengan autoclaf selama 10 menit (setelah tekanan naik mencapai 1 bar).

-         Setelah selesai, PDA dalam tabung  diletakkan miring hingga media membeku.

-         Setelah PDA membeku, PDA sudah dapat digunakan…

2.      Nutrient Agar

a.       Semua bahan di larutkan dalam sebagian aquades

b.      Agar dilarutkan dengan cara dipanaskan dengan aquades lainya

c.       Setelah larut, kedua suspensi di campur

d.      Atur pH 6,8 – 7,2

e.       Masukan ke dalam tabung reaksi atau Erlenmeyer

f.       Di tutup dengan kapas dan di lapisi aluminium foil

g.      Disterilisasi dengan autoclave selama 15 menit pada suhu 120⁰ dan tekanan 15 lbs

BAB III

HASIL DA PEMBAHASAN

A.      Hasil

Terlampir

B.       Pembahasan

Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan(nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya (Indra, 2008)

Nutrient Agar (NA)

 

Foto : Nutrien Agar

Gambar Nutrient Agar

Nutrien agar merupakan media kultur universal untuk pertumbuhan mikroorganisme/bakteri. Jenis bakteri yang dapat tumbuh pada nutrient agar lebih sedikit dibandingkan dengan TSA. Nutrien Agar lebih sering digunakan dibandingkan TSA untuk menghindari terjadi

Kandungan : Pepton dari dari daging, ekstrak dagingn, agar-agar.

Cara pembuatan : Larutkan 20 g/L nutrien agar (bubuk) autoclave 15 menit pada suhu121 ⁰C, PH 7.0±0.2

Tutup : kapas putih

Nutrient agar (NA) termasuk medium semi alamiah karena tersusun atas bahan alami (daging) danbahan sintesis (pepton dan agar). PDA digunakan untuk menumbuhkan semua mikroba. Fungsi bahan yang digunakan pada medium NA :- Daging : sebagai sumber vitamin B, mengandung nitrogen organik dan senyawa karbon.- Pepton : sebagai sumber utama nitrogen organic dan sumber nutrisi- Agar : Untuk memadatkan medium NA.- Aquadest : Untuk melarutkan agar, pepton, dan daging Pembuatan medium Nutrien Agar (NA) menggunakan bahan utama beef ekstrak 5 g, peptom 3 g danagar 3 g. Pada awal pengamatan medium Nutrien Agar, sebelum proses sterilisasi berwarna kuning,setelah sterilisasi warna medium menjadi agak coklat. Pada pembuatan medium NA ini ditambahkan pepton agar mikroba cepat tumbuh, karena mengandung banyak N2 (Dwidjoseputro, 1994). Agar yang digunakan dalam proses ini untuk mengentalkan medium sama halnya dengan yang digunakan pada medium PDA yang juga berperan sebagai media tumbuh yang ideal bagi mikroba (Schlegel, 1993)

Nutrien agar adalah medium umum untuk uji air dan produk dairy. NA juga digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof. Media ini merupakan media sederhana yang dibuat dari ekstrak beef, pepton, dan agar. Na merupakan salah satu media yang umum digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air, sewage, produk pangan, untuk membawa stok kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni.
Untuk komposisi nutrien adar adalah eksrak beef 10 g, pepton 10 g, NaCl 5 g, air desitilat 1.000 ml dan 15 g agar/L. Agar dilarutkan dengan komposisi lain dan disterilisasi dengan autoklaf pada 121°C selama 15 menit. Kemudian siapkan wadah sesuai yang dibutuhkan.

Medium NA berdasarkan susunan kimianya merupakan medium non sintetik/semi ilamiah, berdasarkan konsistensinya merupakan medium padat. Medium ini digunakan untuk pertumbuhan bakteri. Komposisi NA yang terdiri dari: ekstrak beef berfungsi sebagai sumber karbohidrat, mengandung senyawa nitrogen organik yang dibutuhkan mikroba.Pepton merupakan sumber protein dan penghasil nitrogen. Bacto agar berfungsi sebagai pemadat mediumAquadest berfungsi sebagai pelarut.

Potato Dextrose Agar (PDA)

Media yang paling umum digunakan untuk menumbuhkan jamur/kapang/fungi adalah media PDA (Potato Dextrose Agar). Bahan baku utama media ini adalah ekstrak kentang dengan penambahan sumber karbon berupa dextrose. Saat ini sudah ada media PDA instant dari Merk, tetapi harganya selangit. Terakhir aku beli tahun lalu sudah di atas rp. 1 jt/kg. Membuat PDA sendiri cukup mudah, namun gula dextrose-nya yang harganya juga lumayan mahal. Untuk penggunaan rutin pemakaian PDA cukup memakan biaya.

Oleh karena itu untuk perlu sedikit kreativitas dan modifikasi agar biaya kultur menjadi lebih mudah. Salah satu modifikasi media PDA yang sudah sering kami lakukan di laboratorium adalah dengan menganti sumber karbon dengan sumber karbon yang mudah didapat dan murah, yaitu: GULA PASIR alias Sukrosa. Kemudian untuk agarnya juga menggunakan agar teknis yang harganya relatif murah. Kalau terpaksa tidak ada juga bisa menggunakan agar Swallow yang banyak dijual di warung-warung.

PDA digunakan untuk menumbuhkan atau mengidentifikasi yeast dan kapang. Dapat juga digunakan untuk enumerasi yeast dan kapang dalam suatu sampel atau produk makanan. PDA mengandung sumber karbohidrat dalam jumlah cukup yaitu terdiri dari 20% ekstrak kentang dan 2% glukosa sehingga baik untuk pertumbuhan kapang dan khamir tetapi kurang baik untuk pertumbuhan bakteri. Cara membuat PDA adalah mensuspensikan 39 g media dalam 1 liter air yang telah didestilasi. campur dan panaskan serta aduk. Didihkan selama 1 menit untuk melarutkan media secara sempurna. Sterilisasi pada suhu 121°C selama 15 menit. Dinginkan hingga suhu 40-45°C dan tuang dalam cawan petri dengan pH akhir 5,6+0,2.

Pembuatan medium Potato Dextrose Agar (PDA), kentang sudah ditimbang dan direbus, dengan ukuran kentang 50,31 g dan agar 4,03 g. Disini menggunakan agar untuk mengentalkan medium. Ekstrak kentang dan agar disetir dan diatur suhu dan pHnya. Sebelum dilakukan sterilisasi, medium berawarna kuning, setelah disterilisasi dalam autoklaf medium berwarna kecoklatan dan didapat endapan berwarna putih. Setelah didinginkan beberapa saat, medium dapat ditanami bakteri (Schegel, 1993).

Media berfungsi untuk menumbuhkan mikroba, isolasi, memperbanyak jumlah, menguji sifat-sifat fisiologi dan perhitungan jumlah mikroba, dimana dalam proses pembuatannya harus disterilisasi dan menerapkan metode aseptis untuk menghindari kontaminasi pada media. Berikut ini beberapa media yang sering digunakan secara umum dalam mikrobiologi.

Lactose Broth

Lactose broth digunakan sebagai media untuk mendeteksi kehadiran koliform dalam air, makanan, dan produk susu, sebagai kaldu pemerkaya (pre-enrichment broth) untuk Salmonellae dan dalam mempelajari fermentasi laktosa oleh bakteri pada umumnya. Pepton dan ekstrak beef menyediakan nutrien esensial untuk memetabolisme bakteri. Laktosa menyediakan sumber karbohidrat yang dapat difermentasi untuk organisme koliform. Pertumbuhan dengan pembentukan gas adalah presumptive test untuk koliform. Lactose broth dibuat dengan komposisi 0,3% ekstrak beef; 0,5% pepton; dan 0,5% laktosa.

EMBA (Eosin Methylene Blue Agar)

Media Eosin Methylene Blue mempunyai keistimewaan mengandung laktosa dan berfungsi untuk memilah mikroba yang memfermentasikan laktosa seperti S. aureus, P. aerugenosa, dan Salmonella. Mikroba yang memfermentasi laktosa menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap dengan kilap logam. Sedangkan mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna. Adanya eosin dan metilen blue membantu mempertajam perbedaan tersebut. Namun demikian, jika media ini digunakan pada tahap awal karena kuman lain juga tumbuh terutama P. Aerugenosa dan Salmonella sp dapat menimbulkan keraguan. Bagaiamanapun media ini sangat baik untuk mengkonfirmasi bahwa kontaminan tersebut adalah E.coli. Agar EMB (levine) merupakan media padat yang dapat digunakan untuk menentukan jenis bakteri coli dengan memberikan hasil positif dalam tabung. EMB yang menggunakan eosin dan metilin bklue sebagai indikator memberikan perbedaan yang nyata antara koloni yang meragikan laktosa dan yang tidak. Medium tersebut mengandung sukrosa karena kemempuan bakteri koli yang lebih cepat meragikan sukrosa daripada laktosa. Untuk mengetahui jumlah bakteri coli umumnya digunakan tabel Hopkins yang lebih dikenal dengan nama MPN (most probable number) atau tabel JPT (jumlah perkiraan terdekat), tabel tersebut dapat digunakan untuk memperkirakan jumlah bakteri coli dalam 100 ml dan 0,1 ml contoh air.

Nutrient Broth

Nutrient broth merupakan media untuk mikroorganisme yang berbentuk cair. Intinya sama dengan nutrient agar. Nutrient broth dibuat dengan cara sebagai berikut :

-          Larutkan 5 g pepton dalam 850 ml air distilasi/akuades.

-          Larutkan 3 g ekstrak daging dalam larutan yang dibuat pada langkah pertama.

-          Atur pH sampai 7,0.

-          Beri air distilasi sebanyak 1.000 ml.

-          Sterilisasi dengan autoklaf.

MRSA (deMann Rogosa Sharpe Agar)

MRSA merupakan media yang diperkenalkan oleh De Mann, Rogosa, dan Shape (1960) untuk memperkaya, menumbuhkan, dan mengisolasi jenis Lactobacillus dari seluruh jenis bahan. MRS agar mengandung polysorbat, asetat, magnesium, dan mangan yang diketahui untuk beraksi/bertindak sebagai faktor pertumbuhan bagi Lactobacillus, sebaik nutrien diperkaya MRS agar tidak sangat selektif, sehingga ada kemungkinan Pediococcus dan jenis Leuconostoc serta jenis bakteri lain dapat tumbuh. MRS agar mengandung:

Protein dari kasein 10 g/L

Ekstrak daging 8,0 g/L

Ekstrak ragi 4,0 g/L

D (+) glukosa 20 g/L

Magnesium sulfat 0,2 g/L

Agar-agar 14 g/L

dipotassium hidrogen phosphate 2 g/L

Tween 80 1,0 g/L

Diamonium hidrogen sitrat 2 g/L

Natrium asetat 5 g/L

Mangan sulfat 0,04 g/L

MRSB merupakan media yang serupa dengan MRSA yang berbentuk cair/broth.

Trypticase Soy Broth (TSB)

TSB adalah media broth diperkaya untuk tujuan umum, untuk isolasi, dan penumbuhan bermacam mikroorganisme. Media ini banyak digunakan untuk isolasi bakteri dari spesimen laboratorium dan akan mendukung pertumbuhan mayoritas bakteri patogen.
Media TSB mengandung kasein dan pepton kedelai yang menyediakan asam amino dan substansi nitrogen lainnya yang membuatnya menjadi media bernutrisi untuk bermacam mikroorganisme. Dekstrosa adalah sumber energi dan natrium klorida mempertahankan kesetimbangan osmotik. Dikalium fosfat ditambahkan sebagai buffer untuk mempertahankan pH.

Plate Count Agar (PCA)

PCA digunakan sebagai medium untuk mikroba aerobik dengan inokulasi di atas permukaan. PCA dibuat dengan melarutkan semua bahan (casein enzymic hydrolisate, yeast extract, dextrose, agar) hingga membentuk suspensi 22,5 g/L kemudian disterilisasi pada autoklaf (15 menit pada suhu 121°C). Media PCA ini baik untuk pertumbuhan total mikroba (semua jenis mikroba) karena di dalamnya mengandung komposisi casein enzymic hydrolisate yang menyediakan asam amino dan substansi nitrogen komplek lainnya serta ekstrak yeast mensuplai vitamin B kompleks.

APDA

Media APDA berfungsi untuk menumbuhkan dan menghitung jumlah khamir dan yeast yang terdapat dalam suatu sampel. Khamir dan yeast akan tumbuh dengan optimal pada media yang sesuai. Adanya asam tartarat dan pH rendah maka pertumbuhan bakteri terhambat. APDA dibuat dengan merebus kentang selama 1 jam/45 menit, agar dilelehkan dalam 500 ml air. Campurkan ekstrak kentang dalam agar lalu ditambahkan glukosa dan diaduk rata. Pada APDA jadi ini juga ditambah asam tartarat.

VRBA (Violet Red Bile Agar)

VRBA dapat digunakan untuk perhitungan kelompok bakteri Enterobactericeae. Agar VRBA mengandung violet kristal yang bersifat basa, sedangkan sel mikroba bersifat asam. Bila kondisi terlalu basa maka sel akan mati. Dengan VRBA dapat dihitung jumlah bakteri E.coli. Bahan-bahan yang dibutuhkan untuk membuat VRBA adalah yeast ekstrak, pepton, NaCl, empedu, glukosa, neutral red, kristal violet, agar). Bahan-bahan tersebut kemudian dicampur dengan 1 liter air yang telah didestilasi. Panaskan hingga mendidih sampai larut sempurna. Dinginkan hingga 50-60°C. Pindahkan dalam tabung sesuai kebutuhan, pH akhir adalah 7,4. Campuran garam bile dan kristal violet menghambat bakteri gram positif. Yeast ekstrak menyediakan vitamin B-kompleks yang mendukung pertumbuhan bakteri. Laktosa merupakan sumber karbohidrat. Neutral red sebagai indikator pH. Agar merupakan agen pemadat.

PGYA

Media ini berfungsi untuk isolasi, enumerasi, dan menumbuhkan sel khamir. Dengan adanya dekstrosa yang terkandung dalam media ini, PGYA dapat digunakan untuk mengidentifikasi mikroba terutama sel khamir. Untuk membuatnya, semua bahan dicampur dengan ditambah CaCO3 terlebih dahulu sebanyak 0,5 g lalu dilarutkan dengan akuades. Kemudian dimasukkan dalam erlenmeyer dan disumbat dengan kapas lalu disterilisasi pada suhu 121°C selama 15 menit.

BAB IV

KESIMPULAN

Media yang dibuat harus disesuaikan dengan karakteristik dari jenis mikroba yang akan ditumbuhkan. Aspek lingkungan seperti suhu, pH, kecukupan nutrien media dan kontaminasi perlu dikondisikan dengan sebaik-baiknya agar mikroba yang ditumbuhkan dengan baik.

Media merupakan bahan yang terdiri atas campuran nutrisi, yang digunakan sebagai tempat menumbuhkan mikroba

Pada proses pengenceran di gunakan peptone untuk membuat medium cair, sedangkan untuk media cawan agar menggunakan PCA dan PDA.

Diharapkan dapat menjaga kondisi aseptis lingkungan serta perlengkapan dalam pembuatan media agar dapat menghasilkan mikroba yang diinginkan.

Sebaiknya praktikan menggunakan alat-alat praktikum yang steril dan juga bekerja aseptik dalam pembuatan media sehingga mendapatkan media yang baik untuk digunakan pada percobaan selanjutnya.

DAFTAR PUSTAKA

Diliello. R. L. 2002. Methods In Rood and Dairy Microbiology. Avy Publishing. Inc. New York.

Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta.

Hadioetomo, R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia, Jakarta.

Lim,D. 1998. Microbiology, 2^nd Edition. McGrow-hill book, New york.

Schegel, G.H. 1993. General Microbiologi seventh edition. Cambrige University Press, USA.

Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti, Jakarta.

Stanier, Y. R. Dkk. 2001. The Microbial World. Prenticel Hall. Inc. EigleWood. New Jersey.

Volk , W. A & Wheeler. M. F. 1993. Mikrobiologi Dasar Jilid 1 Edisi ke 5. Erlangga, Jakarta.